Подготовка образцов состоит из 5 этапов: 1. Фиксация Фиксация проводится сразу после удаления образца, подлежащего наблюдению.Он используется для иммобилизации и постоянного сохранения образца в максимально приближенном к живому состоянии.Ее можно проводить с использованием раствора фиксатора или путем замораживания: – Фиксация в растворе фиксатора осуществляется путем погружения биологического материала в раствор формалина.– Фиксация замораживанием заключается в погружении образца в среду для замораживания тканей (в жидком состоянии при температуре окружающей среды и в твердом состоянии при -20°С), которую затем охлаждают в жидком азоте.Замороженный образец сохраняется до секционирования.Этот этап выполняется в форме в соответствии с ориентацией, выбранной для последующего разрезания.2. Встраивание Встраивание – это этап, следующий за фиксацией в фиксативном растворе.Он заключается в отверждении образца в парафиновой среде для заливки, чтобы можно было выполнить секционирование.Необходимо предварительно обезвоживать образец, заменяя молекулы воды в образце этанолом.Поскольку этанол и парафин не смешиваются, сначала используется промежуточный «очищающий» агент, смешивающийся с парафином.После этапа очистки образцы погружают в парафиновые ванны.Эти этапы осуществляются с использованием автомата обезвоживания.Следующий шаг внедрения выполняется с использованием центра внедрения.Образец помещают в форму, заполненную расплавленным парафином, и тщательно ориентируют его по плоскости сечения.Полученный блок затем охлаждают.Затем образец разрезают с помощью микротома.3.Изготовление срезов производят с помощью микротомии или криотомии.Разделение является важным этапом подготовки предметных стекол, поскольку оно обеспечивает правильное наблюдение образца под микроскопом.– Залитые в парафин образцы разрезаются на поперечном сечении с помощью микротома на тонкие ломтики толщиной 5 микрометров.Стеклянные предметные стекла покрываются раствором, содержащим добавку, чтобы срез оставался прикрепленным к предметному стеклу.Затем предметные стекла помещают на горячую пластинку, чтобы обеспечить равномерное распределение образца.После нагревания предметных стекол остатки жидкости удаляются вручную.Затем слайды сушат при комнатной температуре.– Замороженные образцы разрезаются с помощью криостата.Замороженные срезы затем помещают на предметное стекло для хранения при -80°C.Bioalternatives оценивает подходящие условия фиксации и секционирования в соответствии с вашим образцом и вашим исследованием.Выбор этих условий подготовки имеет решающее значение для минимизации артефактов.Заливка в парафин предпочтительна для сохранения тканей;замораживание больше подходит для сохранения ДНК и РНК, а также для маркировки водорастворимых элементов или элементов, чувствительных к среде фиксации.5. Монтаж. Секции монтируются между предметными и покровными стеклами с помощью продукта, обеспечивающего адгезию.Затем слайды готовы к хранению или наблюдению.Для наблюдений флуоресцентной микроскопии используется монтажная среда, чтобы временно уменьшить потери флуоресценции.4. Окрашивание и иммуномаркировка. Окрашивание увеличивает контрастность, позволяя распознавать и дифференцировать различные компоненты биологического материала.Образец сначала депарафинизуют и регидратируют, чтобы полярные красители могли пропитать ткани.Таким образом, различные красители могут взаимодействовать с окрашиваемыми компонентами в соответствии с их сродством.После завершения окрашивания предметное стекло промывают и обезвоживают для этапа монтажа.– Иммуномаркировка позволяет обнаружить отдельные компоненты клеток и тканей (антигены) с помощью поликлональных или моноклональных антител.Раствор, содержащий антитела, наносится на образец, который затем промывается для удаления несвязавшихся антител.
